鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病.本研究根据ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了 3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法.结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360-505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC-B646L、pUC-360-14L和pUC-CD2v的检出限分别为1.572×103拷贝/mL、1.934×103拷贝/mL 和 1.929×103拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2％;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1 215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1 192份样品为阴性,两种方法检测结果一致.本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360-505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义.     

鱼类个性测定方法研究进展

动物个性是指在不同时空条件下动物种内个体间行为的稳定差异。鱼类个性的研究历史已超过50年,但不同时期和不同研究的鱼类个性测定方法存在较大差异,缺乏一个规范的用于量化鱼类个性研究的方法论。本文作者认为,关注鱼类个性的常规测定方法,了解现有个性定义及其生态学意义,规范鱼类个性的常规实验方法是有必要的。本文所涉及的个性是指狭义上的个性,即对勇敢性、探索性、活跃性、好斗性和社会性等个性的研究方法进行综述,规范了鱼类个性的常规测定方法及注意事项,并对过往研究中鱼类个性测定方法的不足之处进行了讨论和展望。     

用于药物评价的体外心脏组织模型研究进展

候选药物对心脏的毒副作用是其在开发过程中被淘汰的重要原因之一.传统药物评价所采用的动物模型存在种属差异、成本高、效率低等缺陷.因此,近年来随着干细胞和生物打印等技术的快速发展,体外心脏组织模型的构建受到了越来越多地关注.本文追踪体外心脏模型构建的起源与发展,综述模型所利用的心肌细胞来源以及二维、三维模型构建的相关技术与方法,着重阐述心肌组织模型血管化的重要性及研究进展,并对该领域未来的发展方向进行展望,以期为体外心肌组织模型在药物评价方面的研究和应用提供新思路.     

利用归一化互相关算法去除吸收强度涨落调制血管造影图像模糊

吸收强度涨落调制成像（AIFM）方法是基于血红细胞和背景组织对低相干光照明的吸收差异,通过在频域分离动态的血红细胞信号和静态的背景信号,实现对近透明活体生物样本全场无标记的光学血管造影成像. 但此成像方法需采集较长的原始图像序列,系统漂移或生物抖动会造成图像模糊,难以实现对某些特定区域的血管造影成像. 本文提出一种结合AIFM成像和归一化互相关算法的新方法来提升血管造影图像的质量：原始的图像序列被分成若干短时序列,每个短时序列先利用AIFM成像算法重构得到全场的血管造影图像;再利用归一化的互相关算法将所有的短时重构图像与第一帧重构图像相匹配,并融合得到最终的血管造影片. 我们以活体鸡蛋胚胎为样品,通过实验验证了利用短时归一化互相关AIFM成像方法,能够消除鸡胚胎心跳引起的图像模糊,从而获得高分辨率和信噪比的心血管造影片,对研究活体动物心脑血管疾病具有重要应用价值.     

内质网应激在乙型脑炎病毒诱导神经元细胞凋亡中的作用及机制研究

内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的激活与创伤、缺血再灌注等病理刺激引起的神经元凋亡有关,流行性乙型脑炎病毒(JEV)感染能够促进神经元凋亡、激活ERS,但ERS在JEV诱导神经元细胞凋亡中的作用尚不清楚.为了研究ERS在JEV诱导神经元细胞凋亡中的作用及机制,本研究以神经细胞株SH-SY5Y为对象,感染JEV并加用ERS激动剂、ERS抑制剂或转染阴性对照(NC) siRNA、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)siRNA,检测细胞存活率、凋亡率、ERS蛋白PERK、肌醇必需酶-1α(IRE1α)、活化转录因子6(ATF6)及凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(Caspase-12)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达.结果 显示:JEV组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平高于对照组,存活率低于对照组(P＜0.05),IRE1α、ATF6的表达水平与对照组比较无显著差异(P＞0.05).与JEV组比较,激动剂组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平显著增加,存活率显著降低(P＜0.05);抑制剂组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平显著降低,存活率显著增加(P＜0.05);与si-NC+JEV组比较,si-PERK+JEV组SH-SY5Y细胞的凋亡率及PERK、CHOP、Caspase-12、Bax的表达水平P显著降低,存活率显著增加(P＜0.05).以上结果表明ERS的PERK通路激活与JEV诱导神经元凋亡有关.     

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)对猪伪狂犬病毒复制的影响

猪伪狂犬病是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种烈性接触性传染病,其感染宿主会触发机体先天免疫应答,引起I型干扰素(Type I interferon,IFN-1)和炎性细胞因子等细胞因子的产生,为研究可诱导产生炎性细胞因子的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)的基因敲除对PRV复制的影响,本试验利用近年来发展迅速的一项规律性短重复回文序列簇/Cas9核酸酶(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated system 9,CRISPR/Cas9)基因定点修饰技术构建猪肾上皮细胞(Porcine kidney epithelial cells,PK15)caspase-1基因稳定敲除细胞系,并通过T7核酸酶检测敲除效率;细胞毒性(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒检测PK15敲除caspase-1增殖影响;采用流式细胞术检测PRV-GFP感染PK15以及PK15-caspase-1^-/-的增殖差异;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测PRV-gB、TK及白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IFN-β、干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes 20,ISG20)mRNA的表达;Western Blot检测PRV-gB蛋白表达;滴度测定检测子代病毒滴度。结果表明,2对特异性单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)均能对caspase-1进行基因编辑,但经T7核酸酶酶切进行基因编辑效率分析结果表明sgRNA2的基因编辑效率较高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明caspase-1基因敲除对PK15以及PK15-caspase-1^-/-细胞活力无影响(P>0.05);流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-caspase-1^-/-中的增殖显著低于PK15细胞(P<0.05);定量RT-PCR结果表明PRV-gB、TK基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著低于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05),而IFN-β、ISG20基因在PK15-caspase-1^-/-的mRNA表达显著高于PK15细胞(gB:P<0.05,TK:P<0.05);Western Blot结果表明,PRV的gB蛋白在PK15-caspase-1^-/-的表达显著低于PK15细胞(P<0.05);滴度测定结果表明,敲除caspase-1能够抑制PRV子代病毒的增殖。以上结果均表明caspase-1基因敲除可抑制PRV在PK15细胞中复制。     

黄山松土壤可溶性有机质对氮添加的响应及其与细菌群落的关联

为探究黄山松土壤可溶性有机质(DOM)数量和质量对短期氮(N)添加的响应及其与细菌群落的关联,在福建戴云山自然保护区设置不同N添加水平(0、40和80 kg N·hm^-2·a^-1)试验,采用三维荧光与平行因子联用法,并结合高通量测序手段分别对土壤DOM和细菌群落进行分析。结果表明: 与对照相比,N添加整体降低了0～10和10～20 cm土层可溶性有机碳(DOC)含量和DOM腐殖化指数(HIX),其中,高氮(80 kg N·hm^-2·a^-1)添加下均显著降低。平行因子分析法进一步表明N添加下DOM中类腐殖质组分(C1、C2)的相对含量降低。此外,N添加减少了富营养细菌(变形菌门、酸微菌纲)的相对丰度,而增加了贫营养细菌(斯巴达杆菌纲)的相对丰度。富营养细菌的相对丰度与HIX、C1、C2呈显著正相关,与相对易分解的类富里酸组分(C3)呈显著负相关;而贫营养细菌的情况则相反。说明N添加下不同生活策略的细菌类群对DOM中难分解和易分解组分存在明显的偏好性。我们推测N沉降加剧背景下土壤微生物生活策略的转变可能有助于DOM组分的塑造。     

氨基酸影响尖孢镰孢菌古巴专化型厚垣孢子的形成

香蕉枯萎病是由尖孢镰孢菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）侵染引起的一种土传真菌病害,已严重威胁香蕉产业的健康发展。该病菌产生的厚垣孢子可在土壤中存活多年,是香蕉枯萎病的初侵染源。本研究通过氨基酸添加试验,证明添加甘氨酸可抑制厚垣孢子的形成;通过对该病菌厚垣孢子形成前期、初期、中期和后期的转录组分析,发现氨基酸合成通路中有93个基因的表达水平在厚垣孢子形成过程中发生了显著变化;In silico 分析表明其中10个基因参与调控真菌的氨基酸合成,11个基因参与调控真菌种的生长发育和产孢,19个基因参与调控真菌种的致病性和毒素产生。由此推测,氨基酸合成通路不仅与尖孢镰孢菌古巴专化型厚垣孢子的形成相关,其有可能参与调控该病菌的致病性。     

出芽短梗霉膨大细胞分选及产糖分析

本研究运用Percoll密度梯度离心的方法对出芽短梗霉Aureobasidium pullulans的两种细胞形态进行分选,并对两种形态的细胞进行多糖产量的分析。通过对转速、分选时间、Percoll分离液浓度的优化,确定了两种细胞形态分选效果最佳的条件是Percoll分离液浓度为60%、转速为5 000r/min、离心时间为30min。经过光学显微镜和透射电子显微镜观察发现上层为酵母状细胞（YL）、下层为膨大细胞（SC）,并发现膨大细胞外有明显的薄膜包被,且产大量多糖。也为今后在相应状态下研究出芽短梗霉膨大细胞的其他代谢机理提供了可行的方法,满足后续研究的需要。     

阿霉素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制口腔鳞癌干细胞迁移和侵袭

目的:探讨阿霉素对口腔鳞癌干细胞迁移、侵袭、凋亡的影响及其可能的机制。方法:体外培养人口腔鳞癌细胞系SCC25,通过流式细胞术分选CD44^-和CD44⁺细胞,RT-PCR检测CD44^-和CD44⁺细胞的Oct4、CD133、CD44和GAPDH的m RNA表达;检测和比较CD44^-和CD44⁺细胞的克隆形成能力。CD44+细胞用阿霉素或β-catenin抑制剂LF3进行处理,分别使用Transwell和细胞划痕检测细胞侵袭和迁移能力,一步法TUNEL检测细胞凋亡水平,WB检测β-catenin和TCF-4的蛋白表达。结果:流式细胞术成功分离CD44^-和CD44⁺细胞,RT-PCR检测CD44+细胞高表达Oct4、CD133和CD44 m RNA,CD44-细胞弱表达Oct4m RNA,不表达CD133和CD44 m RNA;CD44⁺细胞的克隆形成能力显示显著强于CD44^-细胞(P<0.05)。阿霉素显著降低了CD44⁺细胞的侵袭能力和迁移能力(P<0.05),显著提高了CD44+细胞的凋亡率(P<0.05);阿霉素显著降低了CD44+细胞β-catenin和TCF-4的蛋白表达(P<0.05),LF3对β-catenin和TCF-4蛋白表达的影响与阿霉素比较无显著差异(P>0.05)。结论:阿霉素可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低口腔鳞癌干细胞迁移、侵袭能力,促进细胞凋亡。